番茄(Lycopersicon esculentumMill.)是世界上重的食用作物。它品种多,适应范围广泛,产量高,营养丰富,食用品质好,用途广泛。据联合国粮农组织(FAO)统计,2003年全世界番茄收获面积为393·4万hm2,总产达10 784·4万t,而我国2003年番茄收获面积达120·5万hm2,总产2885·1万t,但平均单产仅23·9 t/hm2,距番茄高产国家(荷兰45·8 t/hm2,瑞典35·6 t/hm2,挪威30·0 t/hm2)尚有很大差距,而距世界平均单产(27·4 t/hm2)也有一定差距。在我国,限制番茄生产发展、影响单位面积产量的主要原因在于病害的流行危害和逆境条件的制约。农作物青枯病是一种世界性的细菌病害,其中以茄科作物发病严重,番茄受害尤甚。迄今,番茄青枯病在世界各地均有发生,热带、亚热带地区更为严重。在我国,此病在长江以南各地尤其是华南地区发生较为普遍,并且日益严重,造成作物的巨大损失。本文综述了我国番茄抗青枯病育种研究进展,并提出存在的问题及今后研究的重点。

1　、病原鉴定

1·1　病原种的分类变化细菌性青枯病从发现至今已有130余年的历史,1864年印度尼西亚首先报道在烟草上引起毁灭性的损失。随后,美国、澳大利亚也分别报道了马铃薯和番茄的青枯病。1896年美国Erwin Smith将其病原物定名为青枯假单胞杆菌(Pseudomonassolanacearum)。1991年A·C·Hayward的研究表明Pseudomonas分为5个rRNA同源群,P. solanacearum包括在同源群II中。1992年,Yabu-uchi等根据DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交,以同源性分析为基础,建议将其列入Berkholderia solanacearumcomb·nov·(Smith,1896)。随后Yabu-uchi,Gillis等(1995)根据表型特征,脂肪酸图谱,DNA-DNA同源性以及16sRNA序列分析等多元分类研究后,认为B·solanacearum, B·pickettii和Alcaligenes euterophus与典型的布克氏菌种差异很大,建议列入新属Ralstonia中,更名为R·solanacearum。该分类变化已被IJSB(国际细菌学杂志)认可。番茄青枯病学名由PseudomonassolanacearumE·F·Smith改为Ralstonia solanacearum(Smith 1896) comb·nov。广东、重庆、四川、浙江、安徽等地研究结果表明番茄青枯病病原为P.solanacearumE·F·Smith或Ralstonia solanacearum(Smith 1896) comb·nov。

1·2　种下分类

1·2·1　生理小种

青枯菌种下又可分为许多复杂的菌系,国际上公认两个亚分类,即生理小种和生化型。能侵染烟草及多种茄科植物,浸润于烟叶上能产生坏死枯斑反应,在含L—酪氨酸的培养基上能产生大量黑色素定为青枯菌生理小种1；能侵染香蕉和海力康,浸润烟叶产生过敏反应,在L—酪氨酸培养基上不产生黑色素的定为生理小种2；能侵染马铃薯和番茄,对烟草弱侵染,在烟叶上形成黄化斑,在L—酪氨基培养基上产生少量黑色素的定为生理小种3；能侵染马铃薯和茄子、浸润烟叶产生过敏性反应,酪氨酸酶活性中等的定为生理小种4。曾宪铭对广东省62个番茄青枯菌株的寄主反应分析,绝大多数属小种1,只有1株属小种3,没有发现小种2。黄业东等根据番茄青枯菌能侵染烟草和其他茄科植物,尤其是能致茄子萎蔫,并在心叶烟过敏试验中呈现接种点附近深褐色坏死,表现为枯斑反应,将合肥番茄青枯病菌定为小种1。杨琦凤等根据分离的68个菌株对不同寄主的侵染力,确诊重庆地区番茄青枯菌主要属生理小种1。姚革等1986~1989年从四川各地的番茄、茄子、辣椒、姜、马铃薯、烟草和花生等7种作物上分离到154个青枯菌菌株,试验结果表明绝大部分菌株能侵染茄子,并迅速使其萎蔫;也能侵染番茄、辣椒、马铃薯等,但在花生、烟草上表现出抗感差异,病原菌的优势小种为生理小种1号。

1·2·2　生化型

自20世纪60年代以来,国际上对不同寄主上的青枯菌菌株的生化型(生化变种)进行了研究,澳大利亚的Hayward[11]根据青枯菌对三糖(乳糖、麦芽糖和纤维二糖)和三醇(甘露醇、甜醇和山梨醇)的氧化能力差异,把青枯菌分为4个生化型。何礼远[认为,可利用麦芽糖、乳糖、纤维二糖和甘露醇,不利用山梨醇和甜醇,应另属于生化型V。曾宪铭等1995年在广东比较了13种寄主植物129个青枯病菌株对三糖三醇的利用情况,结果表明它们大部分(87·5%)分属于Hayward的4个生化型,以生化型Ⅲ为优势生化型(约65%)。研究结果同时表明,除Hayward的4个生化型外,还存在4个其它的生化类型:

(1)1个能利用3种双糖和甘露醇、山梨醇而不利用甜醇产酸;

(2)3个能利用3种双糖和山梨醇、甜醇而不利用甘露。

姚革等对49个青枯菌株的生化型测定结果表明,供试的青枯菌株分属于3个生化型,其中,Ⅲ型占供试菌的51·0%,Ⅳ型占34·7%,Ⅱ型占14·3%,由此表明,四川省的青枯病菌以生化型Ⅲ为主。黄业东等将合肥番茄青枯菌定为生化型Ⅲ。林维英等研究表明,福建番茄青枯病菌属生化型Ⅲ和Ⅳ,其中以生化型Ⅲ占绝对优势。林美琛等研究认为浙江省番茄青枯病菌主要为生化型Ⅲ,且发现生化型Ⅰ和Ⅴ,并定名了“新型”。曾宪铭等对广东省62个番茄青枯菌株作生化分析,绝大多数为生化变种Ⅲ,10株为生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅱ,确定广东的优势种群为生化变种Ⅲ。杨琦凤等研究认为重庆番茄青枯菌为生化型Ⅲ。小种及生化型(变种)分类单位下菌系仍存在丰富的多样性。曾宪铭等[14]根据青枯菌对茄子、马铃薯、辣椒、烟草、花生等5种作物致病力的差异,将广东29个小种1的菌株分为5个致病型。霍超斌等根据青枯菌对5个抗性不同的番茄材料致病力的差异,将广东32个小种1生化变种Ⅲ的菌株分为9个致病型,其中致病型Ⅱ、Ⅶ为优势类型。刘琼光等将来自广东、广西、湖南等地的85个番茄青枯菌菌株分为4个血清型,其中,血清型Ⅰ为优势类群,占参试菌株总数约70%。

2　、致病机理及抗病机理研究

青枯菌的致病机制相当复杂,目前仍未十分明了。一般认为是菌体从根部微伤侵入并进入输导组织,在其内大量繁殖的菌体及其代谢产生的大分子物质(主要是胞外多糖,EPS)堵塞导管,影响水分运输,导致植株萎蔫。汪国平等证实了EPS具有堵塞致萎作用,但没有细胞毒性,因为它对番茄组织培养过程中叶片脱分化及芽生根都无抑制作用;此外,青枯菌分泌物中还有一类非酶、非EPS的热稳定毒性物质,它有上述抑制作用,其作用可能是使细胞膜透性增加,导致细胞内含物外渗、组织干缩。这类毒性物质与活菌体一样能使番茄愈伤组织变褐,褐变程度与材料在田间的抗性表现相反。乐素菊等对寄主抗病机理进行了初步研究,显微观察表明,抗、感材料存在明显结构性差异,抗病材料导管分子较短、穿孔板数目较多、微管组织细胞壁能吸附细菌,使得菌体的繁殖及扩展减缓;青枯病菌在番茄抗病材料与感病材料植株根内的扩展差异显著,青枯病菌可存在于感病材料皮层薄壁细胞间隙,瓦解细胞壁,形成溶生腔,在抗病材料维管组织中青枯病菌则被细胞壁所吸附,证明抗、感材料都能受细菌入侵,寄主的抗病性主要表现为抗扩展。王卉和任欣正采用不同的方法接种和利用扫描透射电镜观察,研究不同致病力的青枯菌对番茄抗病品种和感病品种的吸附、侵入与繁殖,发现番茄抗病品种与感病品种的植株体内在数量有明显差异,而与青枯菌对番茄根部的吸附关系不显著。电镜观察发现青枯菌强致病力菌株能以游离的形式存在于番茄感病品种根部的细胞间隙中,并能降解植株细胞壁,破坏原生质膜;青枯病强致病力菌株在抗病及感病品种根内均被番茄植株细胞壁吸附,并且被细胞壁周围的浓密物质所包围。

3　、抗性鉴定技术体系的建立

国家攻关项目番茄育种课题采用人工接种方法鉴定抗性,方法有茎接法及根接法两种。茎接法主要用于致病性测定,根接法主要用于抗病性鉴定。根接法又可分为盆栽伤根法及移栽浸根法。盆栽伤根法在育苗盘(杯)中进行,5~6片真叶时用刀插入幼苗两侧土中伤根,再接入菌液;浸根法在移栽时进行,将苗整株拔起,剪去1/3根系,再浸入细菌浓度为1·0×106~1·0×108个/mL的菌液中15 min。移栽浸根法能综合考虑材料的苗期抗性及成株抗性。李乃坚等研究出一种水培鉴定方法,使鉴定更为有效、简便,且易控制环境、减小误差。汪国平等对组培法离体抗性鉴定进行了研究,发现番茄愈伤组织对平板培养滤液及活菌体的褐变反应与大田抗性趋势相反,但未作相关分析,试验所用材料也偏少。汪国平等将印迹法用于番茄青枯病抗性鉴定,结果表明植株在距离根茎部向上25 cm处青枯病菌的检出率高、低与田间植株的感、抗性基本对应,据此认为在不利于青枯病发生的低温季节,印迹法可用于抗病性鉴定。杨琦凤等苗期室内人工接种抗性鉴定设伤根浸根接种法、灌注接种法、剪叶接种法3种处理,结果以伤根浸根接种法更为准确、可靠,并结合苗期室内人工接种鉴定、田间病圃自然诱发鉴定、温室病圃诱发鉴定筛选抗源材料。

4　、抗性遗传规律

由于番茄对青枯病的抗性遗传比较复杂,不同研究者用不同的试验材料进行研究,所得结论不尽相同。李海涛等以感病材料98TL-1,L-402母本自交系、高抗青枯病自交系LS89及感、抗材料配制杂交组合和回交世代为试材,进行番茄抗青枯病遗传机制研究。结果表明:抗病基因对感病基因表现为部分显性;控制LS89番茄抗青枯病自交系的遗传是一个基因,或一个基因起主导作用;番茄抗青枯病抗性遗传受核基因控制,细胞质基因对其影响不大。乐素菊等以不同抗青枯病水平的番茄品种(品系)进行5×5双列杂交的遗传分析表明:番茄对青枯病的抗性至少由3对基因控制;在抗性遗传效应中,加性成分占主导地位;广义遗传力为97%,狭义遗传力为69%;抗病对感病为不完全显性。邓铭光等的研究认为苗期抗性存在加性和显性基因效应,以加性效应为主;抗性的狭义遗传力为63·36%;但抗病对感病为隐性。汪国平等认为广东省的两例研究都在广州地区进行,但结果却不同,进一步说明抗性遗传相当复杂,应在各自的育种计划中对所用材料的抗性进行具体分析,并提出对于以加性效应为主的抗性,在育种中不能期望F1有抗性杂种优势,只有通过杂交选择积累抗性基因,培育抗性更高的育种系,然后再行配组。

5　、抗病品种选育

抗源是抗病育种的基础。我国不是番茄的起源中心,所有的育种材料都从国外引进,包括引进原始材料或引进品种自行分离。华南农业大学李鹏飞教授最早开始抗青枯病育种工作,自20世纪50年代末就着意从国外收集抗性材料,最初引入的抗性材料多具小果及其他不良园艺性状,通过多年杂交及选择,创造了一批抗病、耐湿热、大果型的材料。亚洲蔬菜研究与发展中心(AVRDC)自1972年起开展抗青枯病的研究,培育了一大批适应热带、亚热带地区的番茄抗病材料,并广泛应用于东南亚各国的育种中。郑锦荣等1996年从AVRDC引进的36份材料中筛选出5份抗青枯病能力强、产量和品质表现较好的抗源材料。杨琦凤等对从AVRDC引进的抗源材料进行杂交和回交转育,从分离后代中选出4份高抗青枯病、农艺性状优良、性状稳定的优异材料。在育种方法研究方面,目前,常规的系统选育、杂交育种等方法仍为选育抗病品种的主要方法,但近几年诱变育种、远缘杂交育种以及国内迅速发展的生物技术如组培、体细胞杂交和基因工程等也逐渐应用于抗病育种中。李海涛等采用高抗青枯病的抗源材料与具有符合育种目标的优良经济性状材料进行有性杂交获得的系统材料进行抗青枯病育种方法研究的结果表明,采用幼苗鉴定淘汰感病苗,再对抗性苗进行成株期鉴定及经济性状选择,能有效地筛选到抗性材料。研究结果也表明,番茄抗青枯病育种抗性不易固定,选择难度大,需要较长的育种过程。田长恩等用花粉管通道法将柞蚕抗菌肽5基因导入番茄,得到了具有较强青枯病抗性的转基因植株后代;汪国平等尝试用组培方法筛选抗病突变体。就番茄抗青枯病育种而言,我国南方地区番茄育种者选育出了一批抗病品种,并在生产上大面积推广应用,对有效防治番茄青枯病起到了一定作用。广东利于病害发生的湿热气候条件迫使育种家将青枯病抗性列为主要育种目标之一,并取得了显著成绩。华南农业大学自20世纪60年代、广东省农业科学院自20世纪80年代、广州市蔬菜科学研究所自1994年先后开展番茄抗青枯病育种工

作,培育了许多优良抗病品种,如华南农业大学先后育成0718-3,0769-1,杂交1号、杂交3号、丰顺、大丰顺、好时年、福安、多宝、夏红等品种;广东省农业科学院育成抗青1号、抗青19号、粤红玉、粤宝、粤星、新星、东方红1号等品种;广州市蔬菜科学研究所育成年丰、穗丰、益丰等品种。这些品种大红果、果重75~190 g,耐热抗病、耐贮运、早中晚熟配套,推广销售份额占广东市场85%以上,并向周边省份辐射,如在广西有大面积种植,在江西、福建等省也有部分种植。随着樱桃番茄消费量的日益增加,广东省又开展了抗青枯病樱桃番茄品种的培育研究。广东省农业科学院已推出了一些耐病的樱桃番茄品种,如红箭、红樱桃2号等。湖南省蔬菜研究所选育出了湘番茄3号,南昌市农科所选育出了洪抗1号、5号。

6　、存在的问题与今后研究的重点

番茄青枯菌菌系分化复杂,变异能力强,各地病菌致病力差异明显。现仅有少数省市有明确的鉴定结果,且因实验方法和选用的鉴别寄主抗性水平不同,鉴定结果也不一致。应组织全国协作研究,广泛布点采集病样,集中鉴定,以利于选育品种具有更广阔的市场。目前青枯菌的致病机理及寄主抗病机制尚未十分明确,相关研究文献极少。番茄青枯病抗性遗传规律的研究也无定论,往往因研究者选用的试验材料和方法不同,结果存在争议,导致不同地区应用当地的抗性遗传分析结果指导育种,限制了我国更广泛的抗青枯病育种实践。随着分子生物学的发展,为番茄抗青枯病病理及育种研究提供了新的途径和方法。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子育种技术开始成为育种技术新的制高点。遗憾的是,目前我国尚无真正依靠分子育种技术选育出的番茄新品种,常规育种与分子育种的结合亟待加强。番茄起源于南美洲西海岸地区,16世纪传入欧洲,我国引种栽培历史较短,种质资源极度贫乏,遗传基础狭窄更是成为我国番茄育种取得重大突破的瓶颈。番茄青枯病抗源材料大部分引致亚洲蔬菜研究与发展中心,这些材料在我国番茄抗青枯病品种选育中发挥了巨大作用。但是,现有品种多数单果重偏小,难以满足长江流域消费市场对大果型红果品种的要求,而国内抗青枯病粉果品种更为少见。应加强育种技术和方法研究,采取聚合育种,聚合不同效应的基因,挖掘种质资源,创新育种材料,综合抗病性和更多的优良园艺性状,培育适应不同市场需求的优良品种。